PCR אנאליזירער פראבלעם-פארלעשן: אָפט געשטעלטע פֿראגן און לייזונגען

פּאָלימעראַזע קייט רעאַקציע (PCR) אַנאַליזאַטאָרן זענען וויכטיקע מכשירים אין מאָלעקולאַרער ביאָלאָגיע, וואָס לאָזן פאָרשער צו אַמפּליפיצירן דנאַ פֿאַר אַפּליקאַציעס פון גענעטישע פאָרשונג ביז קלינישע דיאַגנאָסטיקס. אָבער, ווי יעדער קאָמפּלעקסער מיטל, קען אַ PCR אַנאַליזאַטאָר באַגעגענען פּראָבלעמען וואָס ווירקן אויף זיין פאָרשטעלונג. דער אַרטיקל באַהאַנדלט עטלעכע געוויינטלעכע פֿראַגעס וועגןפּי-סי-אַר אַנאַליזירערפראבלעם לייזונג און גיט פראקטישע לייזונגען צו אלגעמיינע פראבלעמען.

1. פארוואס פארגרעסערט זיך נישט מיין PCR רעאקציע?

איינע פון ​​די מערסטע געוויינטלעכע פראבלעמען מיט וואס באניצער שטויסן זיך אן איז די אוממעגלעכקייט פון דער PCR רעאקציע צו פארגרעסערן די ציל דנ״א. דאס קען מען צושרייבן צו עטלעכע פאקטארן:

אומרעכטער פּריימער פּלאַן: מאַכט זיכער אַז אייערע פּריימערס זענען ספּעציפֿיש פֿאַר דער ציל סיקוואַנס און האָבן אַן אָפּטימאַלע שמעלץ טעמפּעראַטור (Tm). ניצט ווייכווארג מכשירים פֿאַר פּריימער פּלאַן צו ויסמיידן ניט-ספּעציפֿישע בינדונג.

נישט גענוג טעמפּלאַט דנ״א: באַשטעטיקט אַז איר ניצט אַ גענוגיקע מאָס טעמפּלאַט דנ״א. צו ווייניק וועט רעזולטירן אין אַ שוואַכער אָדער קיין אַמפּליפיקאַציע.

אינהיביטארן אין דעם מוסטער: קאנטאמינאנטן אין דעם מוסטער קענען אינהיבירן די PCR רעאקציע. טראכט איבער צו רייניקן אייער דנ״א אדער ניצן אן אנדערע עקסטראקציע מעטאד.

לייזונג: קאָנטראָלירט אייער פּריימער פּלאַן, פאַרגרעסערט די טעמפּלאַט קאַנסאַנטריישאַן, און מאַכט זיכער אַז אייער מוסטער כּולל נישט קיין אינהיביטאָרן.

2. פארוואס איז מיין PCR פראדוקט די אומרעכטע גרייס?

אויב אייער PCR פּראָדוקט גרייס איז נישט ווי געריכט, קען דאָס אָנווייַזן אויף אַ פּראָבלעם מיט די רעאַקציע באדינגונגען אָדער ינגרידיאַנץ געניצט.

נישט-ספעציפישע אמפליפיקאציע: דאס קען פאסירן אויב א פריימער בינדט זיך צו אן אומגעוואונטשענעם ארט. קאנטראלירט די ספעציפישקייט פון די פריימערס מיט א געצייג ווי BLAST.

אומרעכטע אנילינג טעמפּעראַטור: אויב די אנילינג טעמפּעראַטור איז צו נידעריק, קען דאָס רעזולטירן אין נישט-ספּעציפֿישע בינדונג. אָפּטימיזאַציע פון ​​אנילינג טעמפּעראַטור דורך גראַדיענט PCR.

לייזונג: באַשטעטיקן פּריימער ספּעציפֿישקייט און אָפּטימיזירן אַנילינג טעמפּעראַטור צו פֿאַרבעסערן די אַקיעראַסי פון PCR פּראָדוקטן.

3. מיין PCR אנאליזירער ווייזט אן ערראר מעסעדזש. וואס זאל איך טון?

טעות מעלדונגען אויף אַ PCR אַנאַליזאַטאָר קענען זיין אַלאַרמירנדיק, אָבער זיי קענען אָפט צושטעלן קלוז צו פּאָטענציעלע פּראָבלעמען.

קאליבראציע פראבלעמען: זייט זיכער אז דער PCR אנאליזירער איז קאליברירט ריכטיג. רעגולערע אויפהאלטונג און קאליבראציע קאנטראלן זענען קריטיש צו באקומען גענויע רעזולטאטן.

ווייכווארג גרופע: מאנchmal קענען ווייכווארג באַגז פאַראורזאַכן פּראָבלעמען. ריסטאַרט דיין קאָמפּיוטער און קאָנטראָלירט פֿאַר ווייכווארג דערהייַנטיקונגען.

לייזונג: זעט די באַניצער מאַנואַל פֿאַר די ספּעציפֿישע טעות קאָד און פֿאָלגט די רעקאָמענדירטע טראָובלעשווטינג טריט. רעגולערע וישאַלט קען פאַרמייַדן פילע פּראָבלעמען.

4. פארוואס זענען מײַנע PCR רעאַקציע רעזולטאַטן נישט קאָנסיסטענט?

נישט-קאנסיסטענטע PCR רעזולטאטן קענען זיין פראַסטרירנד פֿאַר עטלעכע סיבות:

רעאַגענט קוואַליטעט: זיכער מאַכן אַז אַלע רעאַגענטן, אַרייַנגערעכנט ענזימען, באַפערס און dNTPs, זענען פריש און פון הויך קוואַליטעט. אויסגעגאַנגענע אָדער קאָנטאַמינירטע רעאַגענטן קענען פאַרשאַפן וועריאַביליטי.

טערמאַל ציקלער קאַליבראַציע: נישט קאָנסיסטענט טעמפּעראַטור סעטטינגס קענען ווירקן דעם PCR פּראָצעס. רעגולער קאָנטראָלירן די קאַליבראַציע פון ​​דעם טערמאַל ציקלער.

לייזונג: ניצט הויך-קוואַליטעט רעאַגענטן און קאַליברירט אייער טערמאַל ציקלער רעגולער צו ענשור קאָנסיסטענט רעזולטאַטן.

5. ווי אזוי צו פֿאַרבעסערן די עפֿעקטיווקייט פֿון PCR רעאַקציעס?

פֿאַרבעסערן די עפֿעקטיווקייט פֿון PCR רעאַקציעס קען פֿירן צו העכערע טראָגן און מער פֿאַרלעסלעכע רעזולטאַטן.

אָפּטימיזירן רעאַקציע באדינגונגען: עקספּערימענטירן מיט פֿאַרשידענע קאָנצענטראַציעס פֿון פּריימערס, טעמפּלאַט דנאַ און MgCl2. יעדע PCR רעאַקציע קען דאַרפֿן באַזונדערע באדינגונגען פֿאַר אָפּטימאַלער פאָרשטעלונג.

ניצט הויך-פידעליטי ענזימען: אויב אַקיעראַסי איז קריטיש, באַטראַכט ניצן אַ הויך-פידעליטי דנאַ פּאָלימעראַזע צו מינימיזירן ערראָרס בעשאַס אַמפּליפיקאַציע.

לייזונג: דורכפירן אן אָפּטימיזאַציע עקספּערימענט צו געפֿינען די בעסטע באַדינגונגען פֿאַר דיין ספּעציפֿישן PCR סעטאַפּ.

אין קורצן

פראבלעם-פארלעשן אפּי-סי-אַר אַנאַליזירערקען זיין א שווערע אויפגאבע, אבער פארשטיין אלגעמיינע פראבלעמען און זייערע לייזונגען קען באדייטנד פארבעסערן אייער PCR דערפארונג. דורך לייזן די אלגעמיינע פראבלעמען, קענען פארשער פארבעסערן PCR רעזולטאטן און זיכער מאכן פארלעסליכע רעזולטאטן אין מאלעקולארע ביאלאגיע אפליקאציעס. רעגולערע אויפהאלטונג, פארזיכטיקע אויסוואל פון רעאגענטן, און אפטימיזאציע פון ​​רעאקציע באדינגונגען זענען שליסלען צו א געלונגענע PCR אנאליז.