אריינמישונג פאַקטאָרן אין PCR רעאַקציעס

בעת דער PCR רעאקציע, ווערן אָפט באַגעגנט עטלעכע ינטערפירנדיקע פאַקטאָרן.
צוליב דער זייער הויכער סענסיטיוויטי פון PCR, ווערט קאנטאמינאציע באטראכט אלס איינער פון די וויכטיגסטע פאקטארן וואס ווירקן אויף PCR רעזולטאטן און קען פראדוצירן פאלשע פאזיטיווע רעזולטאטן.
גלייך ווי קריטיש זענען די פארשידענע קוועלער וואָס פירן צו פאַלש-נעגאַטיווע רעזולטאַטן. אויב איינער אָדער מער וויכטיקע טיילן פון דער PCR געמיש אָדער די אַמפּליפיקאַציע רעאַקציע אַליין ווערן געשטערט אָדער געשטערט, קען דער דיאַגנאָסטישער אַסיי ווערן געשטערט. דאָס קען פירן צו פאַרקלענערטע עפעקטיווקייט און אפילו פאַלש-נעגאַטיווע רעזולטאַטן.
אין צוגאב צו אינהיביציע, קען פארלוסט פון ציל נוקלעאיק זויער אינטעגריטעט פאסירן צוליב שיפּינג און/אדער סטאָרידזש באדינגונגען איידער מוסטער צוגרייטונג. אין באַזונדער, הויכע טעמפּעראַטורן אדער נישט גענוג סטאָרידזש קענען פירן צו שעדיקן פון צעלן און נוקלעאיק זויערן. צעל און געוועב פיקסאַציע און פּאַראַפין עמבעדינג זענען באַוווסטע סיבות פון דנאַ פראַגמענטאַציע און אַ פּערסיסטענט פּראָבלעם (זען פיגורן 1 און 2). אין די פאַלן, וועט אפילו אָפּטימאַלע איזאָלאַציע און רייניקונג נישט העלפן.

פיגור 1 | ווירקונג פון אימאביליזאציע אויף דנ״א אינטעגריטעט
אַגאַראָזע געל עלעקטראָפאָרעזיס האָט געוויזן אַז די קוואַליטעט פון די דנאַ וואָס איז אפגעזונדערט געוואָרן פון פּאַראַפין סעקשאַנז פון אויטאָפּסיעס האָט זיך שטאַרק געביטן. דנאַ פון פאַרשידענע דורכשניטלעכע פראַגמענט לענג איז געווען פאָרשטעלן אין די עקסטראַקטן דיפּענדינג אויף די פיקסאַציע מעטאָד. דנאַ איז געווען פּרעזערווירט בלויז ווען פיקסירט אין נאַטירלעכע פאַרפרוירענע מוסטערן און אין באַפערד נייטראַל פאָרמאַלין. די נוצן פון אַ שטאַרק זויער בויין פיקסאַטיוו אָדער אַנבאַפערד, פאָרמיק זויער-האַלטנדיק פאָרמאַלין האָט רעזולטירט אין אַ באַטייטיקן פארלוסט פון דנאַ. די איבעריקע פראַקציע איז העכסט פראַגמענטירט.
אויף דער לינקער זייט, ווערט די לענג פון די פראגמענטן אויסגעדריקט אין קילאָבאַסע פּאָרן (kbp)

פיגור 2 | פארלוסט פון אינטעגריטעט פון נוקלעאיק זויער צילן
(א) א 3′-5′ ריס אויף ביידע סטראַנדז וועט רעזולטירן אין א ריס אין דער ציל דנ״א. סינטעז פון דנ״א וועט נאך אלץ פארקומען אויף דעם קליינעם פראַגמענט. אבער, אויב א פּריימער אַנילינג פּלאַץ פעלט אויף דעם דנ״א פראַגמענט, וועט נאר לינעאַרע אַמפּליפיקאַציע פארקומען. אין דעם גינסטיגסטן פאַל, קענען די פראַגמענטן ווידערזעטיקן איינער דעם אַנדערן, אבער די ייעלדס וועלן זיין קליין און אונטער דעטעקציע לעוועלס.
(ב) פארלוסט פון באזעס, הויפטזעכלעך צוליב דעפּורינאציע און טימידין דימער פארמאציע, פירט צו א פארקלענערונג אין דער צאל H-בונדן און א פארקלענערונג אין Tm. בעת דער פארלענגערטער ווארעמונגס-פאזע, וועלן די פריימערס זיך צעשמעלצן פון דער מאטריץ דנ״א און וועלן נישט אויסגליטשן אפילו אונטער ווייניגער שטרענגע באדינגונגען.
(ג) שכנותדיקע טימין באַזעס שאַפֿן אַ TT דימער.
נאך א געוויינלעכע פראבלעם וואס קומט אפט פאר אין מאלעקולארער דיאגנאסטיקס איז די ווייניגער-ווי-אפטימאלע באפרייאונג פון ציל נוקלעאיק זויערן קאמפערד צו פענאל-כלאראפארם עקסטראקציע. אין עקסטרעמע פעלער, קען דאס זיין פארבונדן מיט פאלשע נעגאטיוון. אסאך צייט קען געשפארט ווערן דורך קאכנדיקע ליזיס אדער ענזימאטישע פארדייאונג פון צעל דעבריס, אבער די מעטאד רעזולטירט אפט אין נידעריגע PCR סענסיטיוויטי צוליב נישט גענוגיקע נוקלעאיק זויער באפרייאונג.

אינהיביציע פון ​​פּאָלימעראַזע טעטיקייט בעת אַמפּליפיקאַציע

בכלל, ווערט אינהיביציע גענוצט אלס א קאנטעינער קאנצעפט צו באשרייבן אלע פאקטארן וואס פירן צו נישט-אפטימאלע PCR רעזולטאטן. אין א שטרענג ביאָכעמישן זין, איז אינהיביציע באגרענעצט צו דער טעטיקייט פון דעם ענזיים, ד.ה. עס רעדוצירט אדער פארמיידט סאַבסטראַט-פּראָדוקט קאנווערזשאַן דורך אינטעראַקציע מיטן אַקטיוון אָרט פון דער DNA פּאָלימעראַזע אדער זיין קאָפאַקטאָר (למשל, Mg2+ פאר Taq DNA פּאָלימעראַזע).
קאָמפּאָנענטן אין דער מוסטער אָדער פֿאַרשידענע בופֿערס און עקסטראַקטן וואָס ענטהאַלטן רעאַגענטן קענען גלייך אינהיבירן דעם ענזיים אָדער פֿאַרכאַפּן זייַנע קאָפאַקטאָרן (למשל EDTA), דערמיט אינאַקטיוויִרנדיק די פּאָלימעראַזע און אין דער ריי פֿירן צו פֿאַרמינדערטע אָדער פֿאַלש נעגאַטיווע PCR רעזולטאַטן.
אבער, אסאך אינטעראקציעס צווישן רעאקציע קאמפאנענטן און ציל-אנטהאלטנדיקע נוקלעאיק זויערן ווערן אויך באצייכנט אלס 'PCR אינהיביטארן'. אזוי שנעל ווי די אינטעגריטעט פון דער צעל ווערט צעשטערט דורך אפגעזונדערטקייט און די נוקלעאיק זויער ווערט באפרייט, קענען אינטעראקציעס צווישן דעם מוסטער און זיין ארומיגע לייזונג און פעסטער פאזע פאזע פאסירן. למשל, 'סקעווענדזשערס' קענען בינדן איינצעל- אדער צוויי-שטראנגיקע DNA דורך נישט-קאוואלענטע אינטעראקציעס און אריינמישן זיך מיט אפגעזונדערטקייט און רייניקונג דורך רעדוצירן די צאל צילן וואס עווענטועל דערגרייכן דעם PCR רעאקציע געפעס.
בכלל, PCR אינהיביטאָרן זענען פאַראַן אין רובֿ גוף פלוידס און רעאַגענטן געניצט פֿאַר קלינישע דיאַגנאָסטיק טעסץ (ורעאַ אין פּישעכץ, העמאָגלאָבין און העפּאַרין אין בלוט), דייאַטערי ביילאגעס (אָרגאַנישע קאָמפּאָנענטן, גליקאָגען, פעט, Ca2+ יאָנען) און קאָמפּאָנענטן אין דער סביבה (פענאָלן, שווערע מעטאַלן).

מער פארשפרייטע PCR אינהיביטאָרן קענען געפונען ווערן אין באַקטעריע און עוקאַריאָטישע צעלן, נישט-ציל דנאַ, דנאַ-בינדנדיקע מאַקראָמאָלעקולן פון געוועב מאַטריצעס און לאַבאָראַטאָריע עקוויפּמענט ווי הענטשקעס און פּלאַסטיקס. רייניקונג פון נוקלעיק זויערן בעת ​​אָדער נאָך עקסטראַקציע איז די בילכער מעטאָד פֿאַר באַזייַטיקונג פון PCR אינהיביטאָרן.
היינט קענען פארשידענע אויטאמאטישע עקסטראקציע עקוויפמענט פארטרעטן אסאך מאנועלע פראטאקאלן, אבער 100% אויפבוי און/אדער רייניקונג פון צילן איז קיינמאל נישט דערגרייכט געווארן. מעגליכע אינהיביטארן קענען נאך זיין פאראן אין די גערייניקטע נוקלעאיק זויערן אדער האבן שוין אנגעהויבן ארבעטן. עס עקזיסטירן פארשידענע סטראטעגיעס צו רעדוצירן דעם איינפלוס פון אינהיביטארן. די אויסוואל פון די פאסיגע פאלימעראזע קען האבן א באדייטנדיקן איינפלוס אויף אינהיביטאר טעטיקייט. אנדערע באוויזענע מעטאדן צו רעדוצירן PCR אינהיביציע זענען פארגרעסערן פאלימעראזע קאנצענטראציע אדער צולייגן צוגאבן ווי BSA.
אינהיביציע פון ​​PCR רעאקציעס קען דעמאנסטרירט ווערן דורך די נוצן פון אינטערנער פּראָצעס קוואַליטעט קאָנטראָל (IPC).
מען מוז זיין פארזיכטיג צו באַזײַטיקן אַלע רעאַגענטן און אַנדערע לייזונגען אין דעם עקסטראַקציע קיט, ווי עטאַנאָל, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, יסאָפּראָפּאַנאָל און פענאָל, פֿון דעם נוקלעאיק זויער איזאָלאַט דורך אַ גרינטלעכן וואַשן שריט. דעפּענדינג אויף זייער קאָנצענטראַציע, קענען זיי אַקטיוויזירן אָדער פאַרהיטן PCR.